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【關(guān)鍵詞】,差異表達(dá)基因；差異顯示PCR方法；消減雜交法

［摘要］差異表達(dá)基因與疾病密切相關(guān)，深入研究可在基因水平揭示疾病的發(fā)病機(jī)制，從而探索疾病治療的有效方法。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，各種研究差異表達(dá)基因的方法應(yīng)運(yùn)而生，盡管每種方法都有其缺陷和不足之處，但畢竟為我們提供了切實(shí)可行的研究方法，現(xiàn)就目前的主要研究技術(shù)做一綜述。

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［關(guān)鍵詞］差異表達(dá)基因；差異顯示PCR方法；消減雜交法

Technologyondifferentialgeneanditsapplication

［Abstract］Differentialexpressiongeneisrelatedtothediseases.Tostudythesegenesdeeplymaycontributetoexposethepathogenesisofdiseasesingenelevelandexploretheeffectivemethodstocurethediseases.Withthedevelopmentofmolecularbiology,allkindsoftechnologyappearedtostudydifferentialexpressiongene.Althoughitslimitation,thesemethodsprovidethefeasibletechnologytostudydifferentialexpressiongene.Thearticlereviewedthemajortechnologyofdifferentialexpressiongene.

［Keywords］Differentialexpressiongene;differentialdisplayPCR;subtractivehybridization

在高等生物個(gè)體發(fā)育中，不同組織細(xì)胞在不同時(shí)期的基因表達(dá)按照時(shí)間和空間順序有序地進(jìn)行，稱之為基因的差異表達(dá)；那些異常表達(dá)的基因可能直接或間接關(guān)系到疾病的發(fā)生和易感性。篩選和鑒定這些差異表達(dá)的基因?qū)τ趶幕蛩浇沂炯膊〉陌l(fā)生機(jī)制，探索疾病治療的有效方法具有重要意義。現(xiàn)就目前研究差異表達(dá)基因的主要方法及其原理分述如下。

1cDNA微陣列技術(shù)（cDNAmicroarrayhybridization）

該技術(shù)是指在固相支持物上直接將大量已知序列的探針有序固化于支持物表面，然后與標(biāo)記的樣品雜交，雜交信號(hào)陽(yáng)性的探針序列就是在組織或細(xì)胞中表達(dá)的DNA序列。cDNA微陣列技術(shù)具有商品化的芯片，DNA樣品形成致密的微集陣列，其集成度可達(dá)2萬(wàn)個(gè)點(diǎn)陣/cm2［1］。該技術(shù)可用于大規(guī)模篩選差異表達(dá)基因。Midorikawa等［2］為了闡明雄激素脫發(fā)患者脫發(fā)區(qū)和未受累部位毛乳頭細(xì)胞基因表達(dá)譜的差異，通過(guò)該技術(shù)篩選到107個(gè)差異表達(dá)基因；其中BMP2和ephrinA3的基因表達(dá)顯著下調(diào)，因此認(rèn)為BMP2和ephrinA3在毛發(fā)周期中具有促進(jìn)毛發(fā)生長(zhǎng)的作用。該技術(shù)用于疾病診斷和藥物療效評(píng)價(jià)，用于診斷是否攜帶艾滋病病毒［3］的基因芯片已經(jīng)問(wèn)世；有學(xué)者［4］應(yīng)用該技術(shù)評(píng)估咪喹莫特治療HPV2/27/57引起的生殖器疣，明確了咪喹莫特對(duì)生殖器疣的治療作用。盡管該技術(shù)具有良好的應(yīng)用前景，但目前序列確認(rèn)的人類(lèi)cDNA克隆還相當(dāng)缺乏，在一定程度上局限了DNA芯片技術(shù)的發(fā)展；基因芯片造價(jià)很高，目前只有大制藥公司和研究所能承受，這些都限制了其應(yīng)用范圍。

2基因表達(dá)系統(tǒng)分析（serialanalysisofgeneexpression，SAGE）

SAGE其原理是以mRNA為模板，用生物素標(biāo)記的Oligo（dT）為引物合成雙鏈cDNA，以限制酶進(jìn)行酶切，捕獲cDNA3′端；產(chǎn)物被分為兩部分，分別與包含有標(biāo)簽內(nèi)切酶位點(diǎn)的A、B連接子相接。經(jīng)過(guò)酶切，就有可能得到只有9~10bp的標(biāo)簽序列。每?jī)蓚€(gè)標(biāo)簽的鈍端結(jié)合后成為PCR的模板，以基于A、B連接子的引物進(jìn)行PCR反應(yīng)的結(jié)果是得到了大量每條包含兩個(gè)不同來(lái)源標(biāo)簽的序列，接下來(lái)再用限制酶酶切、連接，就能將多個(gè)不同的標(biāo)簽鏈接在一起，克隆至質(zhì)粒載體中后集中測(cè)序。SAGE可以檢測(cè)不同細(xì)胞間已知基因表達(dá)的具體差異，系統(tǒng)地分析基因表達(dá)的差異。Cornelissen等［5］運(yùn)用該技術(shù)，從艾滋病相關(guān)Kaposi’s肉瘤的基因表達(dá)譜獲得64個(gè)表達(dá)顯著上調(diào)的基因，28個(gè)表達(dá)下調(diào)的基因。Urschitz等［6］應(yīng)用該技術(shù)研究了曬傷皮膚的基因差異，明確表皮在曬傷皮膚的發(fā)病中發(fā)揮主要作用。SAGE技術(shù)的缺點(diǎn)在于工作量大，有大量的測(cè)序及計(jì)算機(jī)分析任務(wù)；對(duì)于尋找新基因而言，僅用長(zhǎng)度為13bp的寡核苷酸探針篩選cDNA文庫(kù)導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果居多。

3差異顯示PCR方法（differentialdisplayPCR,DD-PCR）

利用可以擴(kuò)增所有哺乳類(lèi)mRNA的幾條5′特定引物和幾條3′錨定引物隨機(jī)組合，將cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，這樣對(duì)于相同的cDNA，PCR產(chǎn)物的種類(lèi)多少和分布應(yīng)該是完全一樣的，而對(duì)于不同的cDNA則可以找到差異條帶，它們所代表的cDNA就有可能與細(xì)胞狀態(tài)的改變或疾病狀態(tài)相關(guān)。

差異顯示PCR方法具有快速、所需RNA量少、可同時(shí)顯示多種生物性狀的差異及可以同時(shí)獲得高表達(dá)和低表達(dá)的基因等諸多優(yōu)點(diǎn)；但假陽(yáng)性率高，可高達(dá)70%的假陽(yáng)性條帶［7］；不能反映低拷貝mRNA的差異，對(duì)高拷貝基因有偏向性；獲得的片段多為300bp左右的3′非編碼區(qū)，很難判斷其功能和意義，只能提供研究線索。

哺乳動(dòng)物的創(chuàng)傷愈合常需要數(shù)周至數(shù)月時(shí)間，伴有瘢痕形成且機(jī)制不明，MRL/MPJ（MRL）鼠具有無(wú)瘢痕愈合的能力，Masinde等［8］采用差異顯示PCR方法研究了參與MRL/MPJ（MRL）鼠無(wú)瘢痕創(chuàng)傷愈合的基因，鑒定了36個(gè)與創(chuàng)傷愈合有關(guān)的差異表達(dá)基因，為無(wú)瘢痕創(chuàng)傷愈合的研究提供了靶基因。

4消減雜交法（SH）

經(jīng)典的消減雜交法是將實(shí)驗(yàn)組mRNA（或cDNA）與對(duì)照組cDNA（或mRNA）雜交，去除雜交體和未雜交上的對(duì)照組成分（cDNA或mRNA），得到實(shí)驗(yàn)組獨(dú)有的cDNA或mRNA，這些基因即為差異表達(dá)基因。為克服傳統(tǒng)的消減雜交法的不足，新的消減雜交技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。

4.1代表性差異分析技術(shù)（RDA）原理是首先用DpnⅡ或Sau3AI酶切兩組雙鏈cDNA，兩端接上單鏈接頭R，補(bǔ)平后，用含接頭R序列的引物擴(kuò)增，再用DpnII或Sau3AI去除雙鏈cDNA兩端的接頭R；只給予實(shí)驗(yàn)組雙鏈cDNA兩端再接上單鏈接頭J。將實(shí)驗(yàn)組與驅(qū)動(dòng)組cDNA雜交，雜交反應(yīng)體系中只有實(shí)驗(yàn)組自身雜交形成的雙鏈cDNA才兩端都帶接頭J，補(bǔ)平后可被含有接頭J序列的引物幾何級(jí)擴(kuò)增，而只有一端帶接頭J的雜交體只能被線性擴(kuò)增。將此雜交產(chǎn)物再進(jìn)行第二輪酶切、加接頭、雜交和PCR擴(kuò)增，重復(fù)兩次后，可確保從實(shí)驗(yàn)組中徹底去除與驅(qū)動(dòng)組共有的序列。

其優(yōu)勢(shì)為：（1）高效性，與傳統(tǒng)的消減富集相比，更加敏感，可以篩選出低拷貝的差異基因；（2）可靠性，結(jié)果重復(fù)性好，假陽(yáng)性率非常低。Chang等［9］結(jié)合cDNA-RDA和膜雜交篩選，對(duì)比正常人口腔黏膜上皮和HPV永生化的口腔上皮細(xì)胞系，獲得了384個(gè)差異表達(dá)的克隆，并證實(shí)其中含69種差異基因。[]

cDNA-RDA技術(shù)的局限性在于：（1）得到的差異片段是平均為300~600bp的小片段。（2）由于cDNA較基因組DNA短，消化后可造成cDNA序列兩端信息量丟失。（3）完全無(wú)酶切位點(diǎn)的片段無(wú)法參與RDA篩選。（4）在極低拷貝差異基因的篩選上進(jìn)行了改進(jìn)，但仍有不足［7］。

4.2抑制消減雜交法（SSH）SSH是抑制PCR與消減雜交技術(shù)相結(jié)合的更簡(jiǎn)單快速的分離差異基因的方法。其原理是豐度高的單鏈DNA在退火時(shí)產(chǎn)生同源雜交的速度快于豐度低的單鏈DNA，從而使原來(lái)在豐度上有差別的單鏈DNA相對(duì)含量達(dá)到基本一致；而抑制PCR則是利用鏈內(nèi)退火優(yōu)于鏈間退火的特點(diǎn)，使非目的序列片段兩端反向重復(fù)序列在退火時(shí)產(chǎn)生類(lèi)似發(fā)卡的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)，無(wú)法作為模板與引物配對(duì)從而選擇性地抑制了非目的基因片段的擴(kuò)增。這樣既利用了消減雜交技術(shù)的消減富集，又利用了抑制PCR技術(shù)進(jìn)行了高效率的動(dòng)力學(xué)富集［10,11］。

SSH技術(shù)形成了自身的優(yōu)勢(shì)：（1）提高了特異性，降低了假陽(yáng)性率。（2）具高度靈敏性，克服了低豐度mRNA不易檢測(cè)的問(wèn)題，這個(gè)方法簡(jiǎn)單到只需一輪雜交即可分離出差異基因。（3）提高了基因克隆的效率，提高了信息量，更具代表性。（4）可同時(shí)分離上百個(gè)差異表達(dá)基因。（5）程序相對(duì)簡(jiǎn)單，操作簡(jiǎn)便，接頭設(shè)計(jì)簡(jiǎn)化且不需反復(fù)交換接頭。

許多學(xué)者應(yīng)用該技術(shù)成功獲得針對(duì)不同疾病的靶基因，Yin等［12］發(fā)現(xiàn)T細(xì)胞在感染HIV-1ⅢB后經(jīng)歷了細(xì)胞的凋亡和功能恢復(fù)，于是應(yīng)用SSH技術(shù)構(gòu)建了HIV-1ⅢB感染第7天和第18天的差異基因表達(dá)譜，建立了2個(gè)消減cDNA文庫(kù)，在兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)篩選到200個(gè)高度表達(dá)的差異基因，鑒定了特異性凋亡相關(guān)基因和其他候選興趣基因；Northernblot分析確定了在兩個(gè)時(shí)相的優(yōu)勢(shì)表達(dá)基因，為HIV-1感染的治療提示了新的方式。

盡管SSH技術(shù)具備諸多優(yōu)勢(shì)，但其所需mRNA量達(dá)2μg，樣品來(lái)源較易且新鮮，非酶切位點(diǎn)的突變、缺失或插入均不能有效被發(fā)現(xiàn)；得到的為cDN段尚需擴(kuò)增其全長(zhǎng)；完全無(wú)酶切位點(diǎn)的片段或酶切位點(diǎn)較少的基因組無(wú)法用SSH技術(shù)篩選。

4.3基于PCR的消減雜交法（PCR-basedsubtractivehybridization）該方法是分別將實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的mRNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄；對(duì)于實(shí)驗(yàn)組，利用mRNA的3′polyA尾和5′-GGG帽結(jié)構(gòu)分別在cDNA兩端加上序列相同的錨定引物；對(duì)于對(duì)照組，將其cDNA進(jìn)行隨機(jī)引物PCR擴(kuò)增制備探針，同時(shí)摻入生物素（Biotin-11-dUTP）。然后將實(shí)驗(yàn)組的cDNA與摻有生物素的探針進(jìn)行雜交，雜交反應(yīng)物用連有鏈親和素的磁珠吸附掉雜交體及未雜交上的探針，得到實(shí)驗(yàn)組獨(dú)有的cDNA，然后用錨定引物將其擴(kuò)增并克隆。

該技術(shù)具有兩大優(yōu)勢(shì)：一是雜交后未雜交上的實(shí)驗(yàn)組單鏈cDNA可直接作為模板被擴(kuò)增，所以低豐度的cDNA被擴(kuò)增的幾率大大提高；二是可以直接獲得全長(zhǎng)cDNA，使獲得功能基因的速度大大加快。Li等［13］利用該技術(shù)篩選了抗原活化的樹(shù)突狀細(xì)胞（DC）的差異表達(dá)基因，并成功獲得了新的全長(zhǎng)cDNA：KE04。

Meije等［14］應(yīng)用該技術(shù)從黑素細(xì)胞、痣細(xì)胞和非轉(zhuǎn)移黑素瘤細(xì)胞的差異表達(dá)cDNAs文庫(kù)中，篩選了Ras相關(guān)蛋白R(shí)ab5b、pCMa1和pCMn2基因等12個(gè)新基因；pCMa1的表達(dá)量在轉(zhuǎn)移性惡黑高于原發(fā)性惡黑；pCMn2在轉(zhuǎn)移和非轉(zhuǎn)移惡黑均有表達(dá)，但在正常黑素細(xì)胞和痣細(xì)胞不能檢測(cè)到。Rab5b顯示在高度轉(zhuǎn)移惡黑的表達(dá)顯著低于其他類(lèi)型的惡黑，這3個(gè)cDNAs可能參與了黑素細(xì)胞的早期形成和惡性轉(zhuǎn)化。

盡管這些具有代表性的方法雖然都不是很完善，不能預(yù)期通過(guò)它們得到所有的差異表達(dá)基因，但通過(guò)這些技術(shù)已經(jīng)獲得了大量的重要基因；隨著各種差異表達(dá)基因篩選技術(shù)的不斷完善，許多常規(guī)不能篩選到的低豐度差異表達(dá)基因、全長(zhǎng)cDNA可望得以分離和鑒定。

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