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本文作者：王啟業王義強凡利作者單位：中南林業科技大學生物技術實驗室

南方紅豆杉細胞培養及次生代謝研究

紅豆杉資源非常有限且紫杉醇含量極低，遠遠無法滿足市場的需求。植物細胞培養具有繁殖速度快，培養條件易于優化，培養過程易于人工控制，不受時間、地域等因素的限制等優點。因此，采用紅豆杉細胞培養生產紫杉醇以及對紫杉醇合成代謝途徑進行調控來提高紫杉醇的產量已成為當今國內外學者研究的熱點課題之一，并已取得了較大進展。對其細胞培養、紫杉醇合成與代謝調控、擴大培養及分離純化[16-19]等方面開展了廣泛深入的研究，研究發現，營養調控[20-23]、物理控制[24-26]、前體飼喂[27]、添加抑制劑[28]、誘導子調控[20-21,29-33]、雙液相培養[34]、兩步法培養[35]等一系列技術均能影響南方紅豆杉的次生代謝。細胞離體培養縮短了培養周期，這樣不僅有利于培養條件的優化，也為通過多種誘導途徑來提高細胞中次生代謝產物的含量成為可能，南方紅豆杉組培體系的不斷完善為進一步研究次生代謝產物的合成與代謝奠定了良好基礎。細胞培養的最終目的是為了提高紫杉醇的產量，因此利用生物反應器替代搖瓶進行紅豆杉細胞規模培養以及工業化生產就成為另一個研究熱點和重點。目前，喜馬拉雅紅豆杉[17]、中國紅豆杉[36-37]、歐洲紅豆杉[17]、曼地亞紅豆杉[38]和云南紅豆杉[39]等均實現了生物反應器的大規模培養，部分并已投產[38]。但南方紅豆杉細胞懸浮培養尚未實現生物反應器的大規模培養，還正處在研究階段。另外，近幾年來，國內外利用微生物發酵來生產紫杉醇的研究報道也不少，但目前利用內生真菌來產生紫杉醇的產量并不高，尚未能進行工業化。

南方紅豆杉分子標記研究

近年來，隨著分子生物技術的迅速發展，植物在蛋白質和DNA水平上的遺傳多樣性研究取得了突破性的進展，并在物種鑒定和瀕危物種保護中得到廣泛的應用。20世紀90年代以來，分子標記技術被廣泛用于動、植物遺傳育種、基因診斷、居群遺傳學、生物系統學與進化研究上，如RAPD標記技術和ISSR分子標記技術，這2種分子標志均可揭示種間與種內的遺傳多樣性及其進化的親緣關系（但后者比前者穩定性和重復性要好），可進一步為開展植物分子輔助育種、遺傳轉化及其轉基因等方面的研究提供有價值的理論依據。2000年，王艇等[40]采用RAPD技術，在分子水平上對南方紅豆杉的系統發育進行了探討。2003年，張宏意等[41]通過隨機擴增多態性方法對廣東、湖南、江西3省的12個南方紅豆杉自然居群進行了基因組DNA多態性分析，分析表明南方紅豆杉居群間的遺傳距離與這些居群的地理分布相關，相同或相鄰產地的居群間的遺傳距離較小，不同產地個體間的遺傳距離較大。2005年，王貴榮等[42]通過對6個紅豆杉種進行RAPD遺傳多樣性分析和染色體鑒定，得出南方紅豆杉與中國紅豆杉的遺傳距離最小，西藏紅豆杉與曼地亞紅豆杉的親緣關系最遠，6個紅豆杉種染色體數均為2n=24，為進一步保護和利用中國的紅豆杉資源提供進化分子遺傳學方面的依據。2007年，李振宇[43]根據cpDNA基因間隔區對南方紅豆杉的種群遺傳結構和系統地理進行了研究，同年，黃麗潔[44]采用葉綠體SSR技術對南方紅豆杉的遺傳多樣性和遺傳距離進行了研究，并認為南方紅豆杉具有中等水平遺傳多樣性，不同地區間遺傳分化小，種群和地區間基因流較大。2008年，茹文明等[45]通過RAPD技術對南方紅豆杉8個自然種群的遺傳多樣性進行了分析，得出南方紅豆杉種群瀕危的主要原因不是其遺傳多樣性，而可能是由其本身生物學和生態學特性及其生存環境破壞所致的。為進一步探討南方紅豆杉瀕危原因和對該物種的保護、進化潛力及種質資源利用等方面提供分子遺傳學數據。2009年，張蕊等[46]利用ISSR分子標記對來自10省區15個南方紅豆杉代表性種源進行了種源遺傳多樣性及地理變化、種源遺傳分化等方面的研究，得出了與上面相一致的結論。同年，張玲玲[47]通過RAPD和ISSR2種分子標記對福建省的南方紅豆杉遺傳多樣性進行了初步研究，并對其RAPD和ISSR2種指紋圖譜進行了比較分析。2010年，李乃偉等[48]采用ISSR標記技術對南方紅豆杉遷地保護小種群及其衍生自然種群小斑塊（小居群）的遺傳多樣性進行了分析。結果表明，南方紅豆杉遷地保護各自然小居群間的遺傳距離與其地理生境有關，而與其地理距離并無顯著的相關性。2011年，李乃偉等[49]又對南方紅豆杉野生種群、遷地保護栽培種群及遷地保護衍生種群的遺傳多樣性和遺傳結構進行ISSR分析和比較，得出南方紅豆杉遷地保護衍生種群的遺傳多樣性與野生種群接近，這為南方紅豆杉的物種遷地保護提供了有力依據。

南方紅豆杉基因工程研究

隨著基因工程技術的不斷成熟，植物基因工程在育種和研究天然活性物質生物合成的分子機制上起到了極大的促進作用，它能突破常規育種的局限性，加快變異速度，快速獲得植株新品種。組織培養體系的建立與優化為南方紅豆杉轉基因的研究提供了基礎和前提。目前，紫杉醇生物合成過程中的部分關鍵酶基因已成功克隆并進行了相關功能研究。2007年，燕麗娜等[50]以南方紅豆杉的新鮮嫩葉中基因組DNA為模板，克隆測序得到紫杉烷7β-羥基化酶的全長基因，并對其進行了進化分析。2010年，肖穎等[51]以南方紅豆杉愈傷中提取總RNA，成功得到紫杉二烯合成酶cDNA的全長序列，為南方紅豆杉轉基因做好了前期準備工作。同年，黃仕杰等[52]成功克隆了紫杉醇下游合成途徑關鍵酶之一的紫杉烷13α-羥化酶基因，并對其進行了生物信息學分析，為利用代謝工程技術生產紫杉醇或其前體物質提供了分子基礎。次年，程抒劼等[53]又成功克隆了能夠催化10-去乙酰巴卡亭Ⅲ10位的乙酰，從而生成紫杉醇生物合成途徑中的最后一個雙萜中間體-巴卡亭Ⅲ的10-去乙酰巴卡亭-10-乙酰轉移酶基因，這就為紫杉醇的進一步商業化生產奠定了基礎。隨著紫杉醇合成相關基因的一個個成功克隆，通過DNA重組技術獲得產紫杉醇含量高的轉基因植株即將成為可能。