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1材料與方法

毒桿菌分離菌株FZ2007－1和FZ2007－2、DH5α均為福建省農(nóng)科院畜牧獸醫(yī)研究所分離鑒定并保存。工具酶與主要試劑聚合酶、膠回收試劑盒均購(gòu)自TaKaRa公司；細(xì)菌DNA提取試劑盒、普通肉湯培養(yǎng)基和普通肉湯瓊脂培養(yǎng)基均從BDDifco公司購(gòu)買；脫纖綿羊血購(gòu)自鄭州益康生物工程有限公司。豬丹毒桿菌保護(hù)性抗原SpaA基因PCR引物合成參考副豬丹毒桿菌C43065株的SpaA基因序列設(shè)計(jì)了1對(duì)可以擴(kuò)增SpaA全長(zhǎng)基因的特異性引物，上游引物，下游引物S，預(yù)期擴(kuò)增片段為1881bp，引物由TaKaRa公司合成。豬丹毒桿菌DNA的提取復(fù)蘇甘油凍存的細(xì)菌，即用接種針蘸取凍存的細(xì)菌，劃線接種于含5％脫纖綿羊血的普通肉湯瓊脂平板中，37℃倒置培養(yǎng)過(guò)夜；挑取單個(gè)菌落接種于普通肉湯培養(yǎng)基中，37℃振搖培養(yǎng)過(guò)夜；離心沉淀后加入PBS重懸，應(yīng)用DNA提取試劑盒按照說(shuō)明書(shū)提取細(xì)菌DNA，－20℃保存?zhèn)溆谩Ｘi丹毒桿菌SpaA基因的PCR擴(kuò)增、克隆和測(cè)序以提取的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5min；94℃變性，72℃延伸1．5min，35個(gè)循環(huán)；72℃再次延伸10min。電泳后切膠用膠回收試劑盒回收DNA片段并與pMD18－T載體連接，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)菌，涂布于含有氨芐青霉素抗性的LB瓊脂平板上，挑取細(xì)菌進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，通過(guò)PCR鑒定，選取陽(yáng)性質(zhì)粒送TaKaRa公司測(cè)序。豬丹毒桿菌SpaA基因的同源性比對(duì)分析應(yīng)用DNAman生物軟件，對(duì)所測(cè)2株豬丹毒桿菌SpaA基因序列與GenBank中登錄的部分豬丹毒桿菌菌株的SpaA基因進(jìn)行同源性比較，并進(jìn)行發(fā)育進(jìn)化樹(shù)分析。豬丹毒桿菌保護(hù)性抗原SpaA的理化性質(zhì)及功能域分析選取1株豬丹毒桿菌分離株為研究對(duì)象，應(yīng)用ExPASy工具對(duì)豬丹毒桿菌保護(hù)性抗原SpaA的性質(zhì)進(jìn)行分析；應(yīng)用ProtParam分析酶的氨基酸序列組成、相對(duì)分子質(zhì)量、等電點(diǎn)等理化性質(zhì)；分析酶的功能域進(jìn)行蛋白信號(hào)肽預(yù)測(cè)。豬丹毒桿菌SpaA基因二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)應(yīng)用EXPASY服務(wù)器上的SOPMA方案分析預(yù)測(cè)豬丹毒桿菌SpaA蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)。豬丹毒桿菌保護(hù)性抗原SpaA蛋白的B細(xì)胞表位預(yù)測(cè)采用Hopp－Woods親水性參數(shù)、Zim－merman極性參數(shù)、柔韌性參數(shù)、抗原性參數(shù)和Emini表面可及性參數(shù)分別進(jìn)行單參數(shù)預(yù)測(cè)。對(duì)各個(gè)參數(shù)的預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較，最后進(jìn)行綜合分析以確定豬丹毒桿菌SpaA蛋白的B細(xì)胞表位。

2結(jié)果

電泳條帶經(jīng)回收、克隆，以克隆后提取的質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR陽(yáng)性鑒定正確。豬丹毒桿菌SpaA基因的發(fā)育進(jìn)化樹(shù)分析應(yīng)用DNAman軟件對(duì)目的條帶的測(cè)序結(jié)果和Gen－Bank中部分豬丹毒桿菌菌株的SpaA基因進(jìn)行發(fā)育進(jìn)化樹(shù)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)本試驗(yàn)分離的2株豬丹毒桿菌菌株與GenBank中其他菌株在進(jìn)化樹(shù)中分布較遠(yuǎn)，自成一個(gè)分支。豬丹毒桿菌SpaA蛋白的理化性質(zhì)分析選擇豬丹毒桿菌FZ2007－1分離株作為代表性毒株進(jìn)行分析。用E分析豬丹毒桿菌的理化性質(zhì)，結(jié)果顯示，該酶有626個(gè)氨基酸，其相對(duì)分子質(zhì)量為72190．3，理論等電點(diǎn)（PI）為9．04，為偏堿性蛋白質(zhì)。豬丹毒桿菌SpaA蛋白的信號(hào)肽預(yù)測(cè)用分析SpaA蛋白的氨基酸序列信號(hào)肽的存在位置及序列，結(jié)果顯示，該酶氨基酸序列上信號(hào)肽的剪切位點(diǎn)位于第29～30個(gè)氨基酸。豬丹毒桿菌SpaA蛋白的功能域分析將豬丹毒桿菌SpaA蛋白的氨基酸序列提交到ScanPro－site服務(wù)器，對(duì)SpaA蛋白進(jìn)行翻譯后修飾位點(diǎn)結(jié)構(gòu)分析。結(jié)果表明，該蛋白有1個(gè)組蛋白賴氨酸N－甲基轉(zhuǎn)移酶家族元件，1個(gè)細(xì)胞壁結(jié)合重復(fù)元件，8個(gè)肉豆蔻酰化位點(diǎn)豬丹毒桿菌SpaA蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)通過(guò)NPS＠服務(wù)器上的SOPMA方案預(yù)測(cè)SpaA蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)成分，結(jié)果表明，該蛋白主要由α螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲組成，其中，α螺旋有335個(gè)、占53．51％，延伸鏈有78個(gè)、占12．46％，β轉(zhuǎn)角有66個(gè)、占10．54％，無(wú)規(guī)則卷曲有147個(gè)、占23．48％。豬丹毒桿菌SpaA蛋白的B細(xì)胞表位預(yù)測(cè)分別對(duì)SpaA蛋白的極性、親水性、柔韌性、抗原性和表面可及性參數(shù)進(jìn)行預(yù)測(cè)，B細(xì)胞抗原表位的數(shù)目及抗原表位可能出現(xiàn)的肽段有所不同，但均顯示，各種方案所預(yù)測(cè)的參數(shù)值均高于其他區(qū)段。因此，以上多個(gè)區(qū)段形成B細(xì)胞表位的可能性最大。

3討論

結(jié)果表明該片段能夠防止桿菌對(duì)豬的感染。Shimoj等也通過(guò)表?xiàng)U菌SpaA蛋白N端2／3區(qū)域，免疫小鼠后，小鼠可產(chǎn)生較強(qiáng)的免疫保護(hù)力。對(duì)于蛋白的B細(xì)胞表位預(yù)測(cè)，已有多種單參數(shù)預(yù)測(cè)模型和相應(yīng)的分析軟件，但為了克服單參數(shù)預(yù)測(cè)模型的局限性，提高預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性，一般對(duì)多種參數(shù)的預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行綜合考慮，其中比較重要的參數(shù)為親水性參數(shù)、極性參數(shù)和柔韌性參數(shù)。通常蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)與蛋白質(zhì)的B細(xì)胞表位有較大的關(guān)系。豬丹毒是由豬丹毒桿菌引起的一種急性、熱性人畜共患傳染病，其主要特征表現(xiàn)為高熱、急性敗血癥、皮膚疹塊、慢性疣狀心內(nèi)膜炎及多發(fā)性非化膿性關(guān)節(jié)炎。該病分布廣泛、世界各地均有發(fā)生，給世界養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。特別是在最近2年，由于“高熱病”的暴發(fā)，導(dǎo)致豬群免疫力下降，豬丹毒在全國(guó)各地均有零星發(fā)生的報(bào)道，并有小范圍流行的可能性［19－20］。近幾年來(lái)，對(duì)豬丹毒桿菌的分子生物學(xué)和免疫學(xué)進(jìn)行了一些研究，吾魯木汗·那孜爾別克等對(duì)豬丹毒桿菌SpaA基因的原核表達(dá)和重組疫苗的研究結(jié)果表明，SpaA蛋白具有良好的免疫保護(hù)作用。晏鵬飛等通過(guò)研究表明豬丹毒桿菌表面保護(hù)性蛋白A起主要保護(hù)功能的核心區(qū)段為氨基端，且是由抗體介導(dǎo)的免疫保護(hù)。Aimad等克隆和表達(dá)了編碼SpaA蛋白N端的基因片段，通過(guò)West－ernblot檢測(cè)其免疫功能，本試驗(yàn)運(yùn)用SOPMA方案預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)合親水性方案、極性方案、柔韌性方案、Emini表面可及性方案和Jameson－Wolf抗原性指數(shù)方案多種方法綜合分析，發(fā)現(xiàn)該酶以α螺旋（占53．51％）、無(wú)規(guī)則卷曲（占23．48％）、延伸鏈（占12．46％）為主，而β轉(zhuǎn)角只占10．54％；并應(yīng)用不同的方案預(yù)測(cè)了B細(xì)胞表位的優(yōu)勢(shì)區(qū)。本研究基于豬丹毒桿菌SpaA蛋白的氨基酸序列，通過(guò)對(duì)其二級(jí)結(jié)構(gòu)、跨膜區(qū)、親水性、表面可及性與抗原性等多種參數(shù)進(jìn)行綜合分析，預(yù)測(cè)了SpaA蛋白可能的B細(xì)胞優(yōu)勢(shì)表位，為尋找特異性相關(guān)表位用于疫苗的設(shè)計(jì)、診斷試劑研發(fā)、免疫機(jī)理的探討等提供了理論依據(jù)，同時(shí)也為豬丹毒桿菌SpaA蛋白功能研究提供了線索。

作者：林琳江斌吳勝會(huì)張世忠單位：福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院